DETECÇÃO DE GENES ASSOCIADOS AO INCREMENTO NA PRODUÇÃO DE HBF POR UM NOVO MÉTODO “IN VITRO”

A anemia falciforme é uma doença hereditária recessiva causada por uma mutação em um único nucleotídeo no gene da beta globina. Esta mutação provoca uma alteração estrutural na qual o ácido glutâmico é substituído por uma valina acarretando na falcização das hemácias quando desoxigenadas. Alguns fármacos com ação hipometilante são capazes de induzir a expressão de gama globina através da inibição da metilação no promotor desse gene. Porém, pouco se sabe a respeito desta regulação e sobre os genes envolvidos neste processo. Visando compreender esta regulação, células CD34+, de indivíduos controle, foram tratadas com 1μM de Decitabina no 9°dia de cultura celular para indução da produção de Hemoglobina Fetal (HbF). Os níveis de expressão dos fatores de transcrição e modificadores da cromatina foram avaliados por meio da plataforma PCR Array (Qiagen™ Germany). Nesse ensaio, foram evidenciados 24 fatores de transcrição diferencialmente expressos, dentre eles, o HNF4α (Hepatocyte Nuclear Factor 4 Alpha) regulado positivamente em 26,1 vezes, HNF1α (Hepatocyte Nuclear Factor 1 Homeobox A) 20,0 vezes e o TCF7L2 (Transcription Factor 7 Like 2) 5,9 vezes, em células tratadas com Decitabina comparadas ao controle. Selecionamos o gene HNF4α como um candidato para silenciamento utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 em células HUDEP-2 (immortalized human erythroid progenitor) por ser o fator de transcriação com maior valor diferencial de expressão entre os listados. O HNF4α é descrito como um fator de transcrição que regula a expressão de vários genes hepáticos, podendo atuar no desenvolvimento do fígado, rim e intestinos e é expresso em tecido hematopoiético. As células HUDEP-2 foram tratadas com Decitabina 50 nM e coletadas após 72 horas. Os níveis de HbF foram mensurados por citometria de fluxo em triplicas biológicas. A porcentagem de células positivas para HbF em HUDEP-2, tratada com Decitabina, foi de 12,27 ± 0,7% n = 3, enquanto nas células controle 1,0 ± 0,06% n = 3, p < 0,0001. Estes resultados corroboram o aumento da expressão observado nas células CD34+. As células HUDEP-2 foram nucleofectedas com Cas9 high fidelity (104 pmol), complexo crRNA: tracrRNA (120 pmol) e 1uM de gRNA HNF4α usando o kit de células humanas CD34+ no dispositivo AMAXA Nucleofector 4D (Lonza). 48 horas após a nucleofecção, as células HUDEP-2 editadas foram submetidas à seleção de clones e expandidas por aproximadamente 28 dias. O DNA genômico dos clones foi sequenciado, e quatro clones -HNF4α-HUDEP-2 foram encontrados com indels no quarto éxon do gene HNF4α. Esses clones foram expandidos em cultura com um controle, e os níveis de HbF foram quantificados com anticorpo anti-HbF por citometria de fluxo. Os níveis de HbF destes quatro clones foram de 8,2 ± 2,4%, o nível do controle foi de 0,9 ± 0,02% p < 0,0258. Os clones editados, embora não homogeneamente, expressaram significativamente mais HbF do que o controle. Nossos resultados sugerem que o HNF4α pode desempenhar um papel importante na ativação do gene da gama globina em células HUDEP-2. Adicionalmente, o aumento na expressão dos genes TCF7L2 e HNF1α são sugestivos de um possível papel na regulação de HbF. Esses dados são importantes, pois indicam novos possíveis alvos para terapia gênica em hemoglobinopatias